谈基因定位技术在遗传病诊断中的应用

谈基因定位技术在遗传病诊断中的应用

减小字体 增大字体 作者:管理员  来源:本站整理  发布时间:2010-01-27 20:33:16

  摘要: 荧光PCR定量技术(Quantitative PCR)是一种新兴的基因定位技术。这项技术灵敏、简便、快速、不需使用放射性同位素,PCR完成后,通过测序仪的自动识别即可对待测DNA进行定量分析。在遗传病,特别是一些以大片段缺失为主要突变类型的遗传病诊断中,荧光PCR定量技术发挥了很重要的作用。

  关键词:荧光PCR定量技术;基因定位技术;遗传病  
    
  在早期的遗传学分子诊断中,主要依赖于Southern Blotting,寡核苷酸杂交等技术。自1985年Saiki等首次描述聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)以来,PCR技术因为其灵敏特异,省时省力等诸多优点而受到了人们的高度重视,已经应用于生物医学和化学等基础研究的各个领域,并且成为医学临床和法医学研究的强有力分析工具之一[1-3]。然而,近几年来,研究者们不再满足于得知某一特异DNA序列的存在与否,他们更着眼于对其进行精确的核酸定量。尽管把PCR作为一种定量的工具,在技术上还面临着一些挑战。荧光PCR基因定位技术是近十余年来兴起的一种分子生物学技术,与其他定量方法相比,具有灵敏、简便、快速、不需使用放射性同
  位素的特点,在基因表达、传染病和遗传病的诊断等方面迅速得到了广泛应用。
  
  1 荧光PCR基因定位技术的原理
  
  荧光PCR定量技术的主要原理为:在PCR前,通过化学方法在引物的5’端通过共价方式连接一个荧光分子。由于在进行PCR时,引物和待扩增模板5’端的碱基不需要完全匹配,荧光PCR引物和普通PCR引物一样,能够对待测模板进行指数扩增。扩增完成后,根据PCR的产量,将荧光PCR产物直接或按一定比例稀释后,和内标、载样缓冲液混合,在自动测序仪上进行电泳。在自动测序仪内激光的激发下,PCR产物上的荧光分子发出固定波长的激发光,被仪器内的光电管捕获。根据PCR产物从开始电泳到经过光电管的时间,测序仪自动计算出相应产物的实际碱基数。不同泳道之间电泳速度的差别,通过各产物内混合的内标校正。同时,测序仪也自动标出相应产物的荧光强度,该数值就是荧光PCR定量技术对模板进行定量与定位的基础。与非定量PCR分析方法不同,荧光PCR的操作程序有助于评估污染的情况,即测出污染的程度,即使阴性对照产生了正的信号,只要这些信号比实验样品的低得多,依据这样的结果,至少可以推测出实验中所得出的信号是真实的[4-6]。在一定程度上,荧光PCR消除了普通PCR过于敏感、假阳性率高的缺点。荧光PCR常用于研究发病机制、估计病毒的负荷量、监测临床治疗进展或用于诊断遗传缺陷等。通过对靶基因量的检测,将其与疾病的临床表现、临床分型以及各种标志酶的值联系起来,为疾病的诊断和药物治疗监测提供科学的依据。目前,该技术已广泛应用于多种遗传病的诊断和产前筛查,如地中海贫血、儿童型脊肌萎缩症、杜氏/贝氏肌营养不良、胖骨肌萎缩症和各种染色体病等。

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